ARSAKEIO OF PATRA  - ENVIRONMENTAL PROJECTS

Log in
 
Folder linkHome
Folder linkConcrete objectives
Folder linkSubjects
Folder linkSchool
Folder linkProjects - Photos
Folder link2011-2012
Folder link2013-2014
Users on-line: 1 (0 logged)




Ο Φθορισμός ως μέσο διάγνωσης στην Ιατρική και στη Βιολογία

Μαρία Ταξιάρχη (Α΄ Λυκείου), Μιχάλης Καλογεράκης (Β΄ Λυκείου),
Βενετιάνα Πανταζοπούλου (Α΄ Λυκείου), Δημήτρης Φιλλιπάκης (Α΄ Λυκείου),
Κατερίνα Νικολαΐδου (Β΄ Λυκείου).
Υπευθ. Καθηγητής: Βλαχοδημητρόπουλος Δημήτρης (Δρ. Βιολογίας)

e-mail: <lyk-p@ARSAKEIO.GR>

Περίληψη
Φθορισμός είναι ένα φυσικοχημικό φαινόμενο κατά το οποίο ορισμένες ουσίες εκπέμπουν μετά από διέγερση από κάποια ακτινοβολία. Το μήκος κύματος της ακτινοβολίας που παράγεται (φθορισμός) είναι μεγαλύτερο από εκείνο της διεγείρουσας ακτινοβολίας. Υπάρχουν στη φύση ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν, δηλαδή εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό" ή "αυτοφθορισμό". Οι περισσότερες όμως ουσίες ή κυτταρικές δομές που μας ενδιαφέρουν επιστημονικά δεν εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό". Έτσι αυτά τα παρασκευάσματα πρέπει να χρωματισθούν για να δώσουν φθορισμό. Στόχος είναι ο φθορισμός ορισμένων μόνο περιοχών, ουσιών ή οργανιδίων. Ο εξειδικευμένος φθορισμός μπορεί να επιτευχθεί με χρήση φθοριοχρωμάτων τα οποία χρησιμοποιούνται όπως ακριβώς και οι συνηθισμένες ιστολογικές χρωστικές. Ο φθορισμός που παρατηρείται στα παρασκευάσματα που έχουν χρωσθεί με φθοριοχρώματα αναφέρεται ως "δευτερογενής φθορισμός". Το φαινόμενο χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία φθορισμού τα οποία παρότι πρωτοχρησιμοποιήθηκαν πριν από αρκετές δεκαετίες, η χρήση τους τα τελευταία χρόνια έχει δώσει ώθηση στις επιστήμες που τα χρησιμοποιούν. Μερικές από πιο σημαντικές εφαρμογές στη διάγνωση και στην έρευνα είναι ο ανοσοσφορισμός και η υβριδοποίηση με φθοριοχρώματα.
Ανοσοφθορισμός είναι η ιχνηθέτηση αντισωμάτων ή αντιγόνων με φθοριοχρώματα τοποθετημένα σε ειδικά αντισώματα. Ο ανοσοφθορισμός συνεισφέρει τα μέγιστα στη διάγνωση, θεραπεία και κατανόηση νοσημάτων.
Η in situ υβριδοποίηση με φθοριοχρώματα (Fluorescent in situ Hybridization, FISH) έχει συμβάλλει σε σημαντικές ερευνητικές εξελίξεις στην Μοριακή Κυτταρογενετική και έχει ενσωματωθεί στην κλινική πρακτική με διαρκώς αυξανόμενο αριθμό αναλύσεων. Με τη συγκεκριμένη τεχνική, λύνονται προβλήματα που δεν μπορούν να αντιμετωπισθούν με την κλασική ανάλυση καρυοτύπου, αλλά ούτε και με τις μοριακές τεχνικές. Τεχνολογία εξαιρετικά ευαίσθητη και αξιόπιστη βασίζεται στην υβριδοποίηση φθοριοχρωμοσημασμένων ανιχνευτών με το υπό μελέτη γενετικό υλικό. Ως τεχνική διαθέτει μεγάλη διακριτική ικανότητα, καθώς το σημαντικό πλεονέκτημα, ότι μπορεί να εφαρμοσθεί σε πυρήνες, οπότε δεν εξαρτάται από την παρουσία διαιρούμενων κυττάρων στο αναλυόμενο δείγμα.

Λέξεις κλειδιά: Φθορισμός, Φθοριοχρώματα, Αντισώματα, Υβριδοποίηση, Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες, FISH

Εισαγωγή
Ως φθορισμός ορίζεται η εκπομπή φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος από μια ουσία η οποία ακτινοβολείται από φως μικρότερου μήκους κύματος (Εικόνα 1). Την παραπάνω ιδιότητα την εκμεταλλευόμαστε στα μικροσκόπια φθορισμού. Στον φθορισμό χρησιμοποιείται υπεριώδες φως (UV) το οποίο πέφτει πάνω στα ηλεκτρόνια των ατόμων του φθοριοχρώματος. Τότε αυτά διεγείρονται και απελευθερώνουν με τη μορφή φωτονίων την ενέργεια που προσέλαβαν. Μέρος της αρχικής διεγείρουσας ενέργειας καταναλώνεται με αποτέλεσμα το φθοριόχρωμα να εκπέμπει φως μικρότερης ενέργειας (μεγαλύτερου μήκους κύματος) από τη διεγείρουσα ακτινοβολία.


Η ανακάλυψη της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP
Η εξαιρετικής σημασίας πρωτεΐνη που φθορίζει σαν πυρακτωμένο μέταλλο μέσα στο σκοτάδι των θαλασσών, η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green fluorescent protein, GFP) (Εικόνα 2), ανακαλύφθηκε το 1962 στην ωραιότατη και επιβλητική μέδουσα (τσούχτρα, jelly-fish) Aequorea Victoria από τον Ιάπωνα επιστήμονα Osamu Shimomura, ο οποίος είχε ξεκινήσει τη μελέτη των βιοφθοριζόντων θαλάσσιων οργανισμών, και ιδιαίτερα της μέδουσας Aequorea Victoria από τη δεκαετία του 1960. Από τότε η πρωτεΐνη αυτή έγινε ένα από τα σπουδαιότερα εργαλεία που χρησιμοποιούνται στη σημερινή βιοεπιστήμη. Με τη βοήθεια της GFP οι ερευνητές ανάπτυξαν τρόπους για να παρακολουθούν τις διεργασίες των βιολογικών οργανισμών, που δεν ήταν δυνατό παλαιότερα να παρατηρηθούν, όπως η ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων στον εγκέφαλο και ο τρόπος διάχυσης των καρκινικών κυττάρων.

Τα βιολογικά συστήματα έχουν χιλιάδες πρωτεΐνες στο εσωτερικό των κυττάρων τους, που ελέγχουν βασικές και ποικίλες χημικές διεργασίες. Εάν οι πρωτεϊνικοί αυτοί μηχανισμοί δεν λειτουργούν ικανοποιητικά, τότε προκαλούνται διάφορες ασθένειες. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο ήταν αναγκαίο οι βιοεπιστήμονες να χαρτογραφήσουν τον ρόλο των διάφορων πρωτεϊνών στο σώμα των έμβιων όντων. Η GFP βοήθησε τις βιοεπιστήμες στον τομέα αυτό μέσω ποικίλων φθοριζόντων πρωτεϊνικών προϊόντων. Με τη χρήση τεχνικών DNA, οι ερευνητές μπορούν τώρα να συνδέσουν την GFP με άλλες ενδιαφέρουσες, αλλά αόρατες, πρωτεΐνες. Η GFP με αυτό τον τρόπο γίνεται ιχνοδείκτης φθορισμού που επιτρέπει την παρακολούθηση, τη θέση και τις διασυνδέσεις στις ιχνοθετημένες πρωτεΐνες.

Οι επιστήμονες μπορούν επίσης με τη βοήθεια της GFP να παρακολουθήσουν την πορεία και κατάληξη διαφόρων κυττάρων, τις βλάβες σε νευρικά κύτταρα κατά την ασθένεια Alzheimer's ή πώς δημιουργούνται τα β-κύτταρα (beta cells), που παράγουν την ινσουλίνη, στο πάγκρεας ενός αναπτυσσόμενου εμβρύου. Σε ένα επίσης πρωτοποριακό πείραμα, οι ερευνητές πέτυχαν να ιχνοθετήσουν διάφορα νευρικά κύτταρα στον εγκέφαλο ενός ποντικού με ένα καλειδοσκόπιο από χρώματα.

Είδη Φθορισμού
• Απλός Φθορισμός
Απλός φθορισμός λέγεται εκείνος κατά τον οποίο μια ουσία φωτιζόμενη από μια φωτεινή δέσμη εκπέμπει ακτινοβολία του αυτού μήκους κύματος με την ακτινοβολία που απορροφά από την δέσμη. Σήμερα αυτό ερμηνεύεται με την θεωρία των κβάντων λαμβάνοντας υπ΄όψη ότι το ηλεκτόνιο του ερεθισμένου ατόμου ανυψούμενο αρχικά σε ψηλότερη στάθμη ενέργειας στη συνέχεια επανέρχεται στην αρχική κατάσταση.
• Φθορισμός εξ ευαισθητοποίησης
Κατά την σύγκρουση των ερεθισμένων ατόμων με τα άτομα άλλων μεταλλικών ατμών πραγματοποιείται μια μεταβίβαση ενέργειας ερεθισμού με συνέπεια τα άτομα να καθίστανται φθορίζοντα και να εκπέμπουν όλες τις γραμμές του φάσματος σε μήκος κύματος μεγαλύτερο εκείνου της προσπίπτουσας αρχικά ακτινοβολίας.
• Φθορισμός σύγκρουσης
Κατά την ισχυρή θέρμανση αερίων πρέπει να δημιουργούνται αφενός συγκρούσεις μορίων, κατά τις οποίες η κινητική ενέργεια αυτών μετατρέπεται σε κβαντική ενέργεια (συγκρούσεις α΄ είδους) προκαλώντας έτσι την θερμική ακτινοβολία των φλογών, και αφετέρου συγκρούσεις κατά τις οποίες αντίστροφα η κβαντική ενέργεια μετατρέπεται σε θερμική διαταραχή (συγκρούσεις χωρίς ακτινοβολία) δηλαδή β΄ είδους.

Φθοριοχρώματα ή φθορίζουσες χρωστικές
Είναι ειδικές χημικές ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν και χρησιμοποιούνται στον ανοσοφθορισμό (βλ. παρακάτω) για τη σήμανση των αντισωμάτων. Κάθε φθοριόχρωμα απελευθερώνει φθορίζον φως συγκεκριμένου μήκους κύματος το οποίο καθορίζεται από το ποσό της ενέργειας που καταναλώνεται κατά την διέγερση των ηλεκτρονίων του.
Μερικά από τα πιο σημαντικά φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται για την ιχνηθέτηση ιστών και μορίων DNA παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Το Ex εκφράζει το μήκος κύματος της αρχικής ακτινοβολίας διέγερσης και το Em εκφράζει το μήκος κύματος της ακτινοβολίας εκπομπής.

Μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescent).
Με τα Μικροσκοπία φθορισμού πραγματοποιείται μελέτη ουσιών που μπορούν να διεγερθούν και να φθορίσουν. Αν και είναι αρκετές δεκαετίες από τότε που πρωτοχρησιμοποιήθηκαν, τα τελευταία χρόνια η χρήση τους έχει δώσει μια νέα ώθηση στις επιστήμες που τα χρησιμοποιούν. Από πλευράς κατασκευής το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένα κοινό μικροσκόπιο στο οποίο όμως το παρασκεύασμα μπορεί να φωτίζεται εκτός από το κλασσικό τρόπο και με υπεριώδη ακτινοβολία. Οι φακοί των μικροσκοπίων αυτών είναι ειδικής κατασκευής, από γυαλί που δεν εμφανίζει "αυτοφθορισμό", και έχουν χαραγμένη πάνω τους τη λέξη Fluor ή Ultrafluor, μπορούν όμως να χρησιμοποιηθούν και για παρατήρηση σε διάταξη φωτεινού πεδίου.
Το μήκος κύματος της ακτινοβολίας που παράγεται (φθορισμός) είναι μεγαλύτερο από εκείνο της διεγείρουσας ακτινοβολίας (νόμος του Stokes). Επομένως μια φθορίζουσα ουσία μπορεί να διεγερθεί με μια ακτινοβολία της περιοχής του υπεριώδους που είναι αόρατη και να παραχθεί μια ακτινοβολία που να είναι ορατή. Το φαινόμενο αυτό χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία φθορισμού για τη παρατήρηση ουσιών ή κυτταρικών δομών που είτε φθορίζουν από τη φύση τους είτε γίνονται φθορίζουσες με τη χρήση χημικών ουσιών, "χρωστικών", που φθορίζουν.
Τα βασικά τμήματα αυτών των μικροσκοπίων είναι τα ακόλουθα: (Εικόνα 3)
1. Φωτεινή πηγή – παρέχει ενέργεια υπό μορφή φωτονίων. Χρησιμοποιούνται λυχνίες υδραργύρου ή αλογόνου.
2. Διεγερτικός ηθμός – αφήνει να περάσει μόνο η ακτινοβολία που διεγείρει το φθοριόχρωμα.
3. Πυκνωτής – κατευθύνει και εστιάζει το επιλεγμένο φως που εκπέμπεται από το παρασκεύασμα.
4. Αντικειμενικός φακός – συγκεντρώνει το φως που εκπέμπεται από το παρασκεύασμα.
5. Διχροϊκό κάτοπτρο - επιτρέπει τη διέλευση των επιλεγμένων μηκών κύματος προς μια μόνο κατεύθυνση.
6. Ηθμός φραγμού – αφήνει να περάσει μόνο ο φθορισμός.
7. Προσοφθάλμιος φακός – μεγεθύνει και καθιστά ορατό το φθορισμό του δείγματος.
 

• Φίλτρα
Χρησιμοποιούνται για την απομόνωση ακτινοβολιών συγκεκριμένων μηκών κύματος αλλά και την προστασία του δείγματος από ακτινοβολία UV και την υπέρυθρη από πηγή φωτισμού. Όταν χρησιμοποιούμε περισσότερες της μιας φθορίζουσες χρωστικές μπορεί τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής των χρωστικών να επικαλύπτονται με αποτέλεσμα να πρέπει να τα διαχωρίσουμε με διαφορετικά φίλτρα.

• Είδη μικροσκοπίων φθορισμού
Ανάλογα με την τοποθέτηση της πηγής υπεριώδους φωτός τα μικροσκόπια φθορισμού διακρίνονται σε δυο τύπους.
α. Το μικροσκόπιο φθορισμού διελεύσεως (transmitted light fluorescence) που είναι και το παλαιότερο, και
β. το μικροσκόπιο φθορισμού προσπίπτοντος ακτινοβολίας (epi-fluorescence).
Από τους δυο τύπους, αυτός που έχει επικρατήσει είναι ο δεύτερος για τους πιο κάτω λόγους:
1. Ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί και σαν συμπυκνωτής με αποτέλεσμα να μην χρειάζεται ρύθμιση
2. Στο μικροσκόπιο φθορισμού διελεύσεως ο φθορισμός παράγεται στα χαμηλότερα τμήματα του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα κατά τη διέλευση της ακτινοβολίας μέσα από το παρασκεύασμα αυτή να διαχέεται. Έτσι με αυτό το μικροσκόπιο μπορούμε να παρατηρήσουμε παρασκευάσματα με μικρό μόνο σχετικά πάχος. Αντίθετα στο μικροσκόπιο προσπίπτοντος ακτινοβολίας επειδή και ο φωτισμός και η παρατήρηση γίνονται από την ίδια πλευρά του παρασκευάσματος η εικόνα από φθορισμό είναι πολύ πιο φωτεινή, με λιγότερο θόρυβο και κατά συνέπεια καλύτερης ποιότητας.
3. Στο μικροσκόπιο φθορισμού προσπίπτουσας ακτινοβολίας, η προσπίπτουσα ακτινοβολία και η ακτινοβολία από φθορισμό δεν συγχέονται. Η πρώτη οδεύει μέσα από το παρασκεύασμα προς τα κάτω και χάνεται, με αποτέλεσμα να μην επηρεάζει την εικόνα από φθορισμό.

Μερικά από τα πλεονεκτήματα της παρατήρησης ή διάγνωσης με μικροσκόπιο φθορισμού είναι:
1. Ευαισθησία. Απαιτείται πολύ μικρή συγκέντρωση του φθοριοχρώματος (διαλύσεις 1/10.000 -1/100.000) με αποτέλεσμα τη προστασία του παρασκευάσματος από τεχνητές αλλοιώσεις (artefacts), κάτι ιδιαίτερα σημαντικό σε ανοσοβιολογικές τεχνικές όπου οι διάφορες χημικές ουσίες μπορεί να επηρεάσουν την αντιγονικότητα του αντιορού.
2. Εξειδίκευση. Οι σύγχρονες μέθοδοι προετοιμασίας παρασκευασμάτων, τα νέα φθοριοχρώματα και τα φίλτρα δίνουν ένα μεγάλο βαθμό εξειδίκευσης με αποτέλεσμα η τεχνική να είναι πολύ αξιόπιστη.
3. Ταχύτητα και ευκολία. Τα παρασκευάσματα μπορούν να παρατηρηθούν χωρίς σχεδόν καμία προετοιμασία.
4. Εφαρμογή. Οι ίδιες τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν σε όλους τους κλάδους της βιοϊατρικής όπως είναι η ιολογία, μυκητολογία, κυτταρολογία, ανοσοβιολογία, παρασιτολογία κλπ.
5. Αξιοπιστία Η μέθοδος είναι πολύ αξιόπιστη λόγω της ευαισθησίας και της εξειδίκευσης των φθοριοχρωμάτων με αποτέλεσμα την ελάττωση των λανθασμένων διαγνώσεων ακόμα και από προσωπικό που δεν έχει μεγάλη εμπειρία.

Ανοσοφθορισμός
Ο ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος κατά την οποία χρησιμοποιούνται φθορίζοντα αντισώματα για την ανίχνευση και εντόπιση αντιγόνου ή αντισώματος σε ιστούς ή κύτταρα.

Τα σημαντικότερα φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται στον ανοσοφθορισμό είναι:
1. Ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη (FITC), εκπέμπει πράσινο χρώμα.
2. Ισοθειοκυανική τετραμεθυλοραδαμίνη (TMRITC), εκπέμπει κόκκινο χρώμα.
3. Φυκοερυθρίνη (RΕ), εκπέμπει πορτοκαλί χρώμα.

• Υποστρώματα για δοκιμασίες ανοσοφθορισμού
Στις μεθόδους ανοσοφθορισμού τα αντισώματα που ανιχνεύονται αντιδρούν με αντιγόνα που βρίσκονται πάνω σε κύτταρα ή ιστούς. Κάθε αντιγόνο είναι ειδικά κατασκευασμένο ώστε να συνδεθεί επιλεκτικά με το υπόστρωμα του. Επειδή η σύνδεση είναι απόλυτα εξειδικευμένη, είναι απίθανο τα αντισώματα να συνδεθούν σε διαφορετικό υπόστρωμα. Τα κύτταρα ή ιστοί βρίσκονται προσκολλημένα πάνω σε ειδικά διαμορφωμένες αντικειμενοφόρες πλάκες. Τα υποστρώματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον φθορισμό είναι τα ακόλουθα:
1. Τομές ιστών. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων και τη μελέτη υλικού βιοψίας.
2. Μονοστιβάδες κυτταροκαλλιεργημάτων. Χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων. Πρόκειται για μονοστιβάδες νεοπλασματικών κυττάρων ανθρώπου ή ζώων (Hep-2, Hela, KB κ.α.). Αναπτύσσονται με μικροκαλλιέργεια σε πλάκες με πολλαπλά βυθίσματα. Μονοστιβάδες από μολυσμένο κυτταροκαλλιέργημα χρησιμοποιούνται για την μελέτη ιών.
3. Εναιωρήματα ζωντανών κυττάρων. Εναιώρημα ζωντανών κυττάρων χρησιμοποιείται για την ανίχνευση επιφανειακών αντιγόνων μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος ή μυελού των οστών και διαφόρων νεοπλασματικών κυττάρων ή αντισωμάτων έναντι αυτών.
4. Επιχρίσματα κυττάρων ή μικροοργανισμών. Είναι κατάλληλα για την ανίχνευση διαφόρων αντισωμάτων.

• Τύποι ανοσοφθορισμού
 Έμμεσος ανοσοφθορισμός
Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα στάδια: (Εικόνα 6)
Στάδιο 1. Ο ορός του ασθενούς του οποίου τα αντισώματα που ψάχνουμε τοποθετείται πάνω σε τομή ιστού που περιέχει το αντιγόνο.
Στάδιο 2. Ακολουθεί έκπλυση με φωσφορούχο διάλυμα για την απομάκρυνση του ασύνδετου αντισώματος.
Στάδιο 3. Κατόπιν προστίθεται το φθορίζον αντίσωμα.
Στάδιο 4. Ακολουθεί νέα πλύση για την απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου φθορίζοντος αντισώματος.
Στάδιο 5. Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού.

Ο άμεσος ανοσοφθορισμός (DFA) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα στάδια:
Στάδιο 1. Πάνω σε τομή ιστού που περιέχει τα αντιγόνα που ψάχνουμε προστίθεται φθορίζον αντίσωμα.
Στάδιο 2. Ακολουθεί πλύση με φωσφορούχο διάλυμα και απομάκρυνση του πλεονάζοντος αντισώματος.
Στάδιο 3. Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού.

Όπως φαίνεται από την περιγραφή των δύο μεθόδων IFA, DFA ο έμμεσος ανοσοφθορισμός χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό των ασθενών ενώ ο άμεσος ανοσοφθορισμός για την ανίχνευση αντιγόνων του ασθενή πάνω σε υλικό βιοψίας.

• Ανοσοφθορισμός με διπλή φθορίζουσα χρώση
Στην τεχνική αυτή γίνεται ταυτόχρονα χρήση δύο αντισωμάτων σημασμένων με διαφορετικά φθοριοχρώματα για την ανίχνευση δύο διαφορετικών αντιγόνων στο ίδιο υπόστρωμα.

• Εφαρμογές ανοσοφθορισμού
1. Ανίχνευση μικροοργανισμών. Βακτήρια, παράσιτα, μύκητες, ρικέτσιες, ιοί ανιχνεύονται σε ιστούς, βιολογικά υγρά και καλλιέργειες με την μέθοδο του άμεσου ή του έμμεσου ανοσοφθορισμού.

2. Ανίχνευση αντισωμάτων έναντι μικροοργανισμών Η ανίχνευση αυτή γίνεται στον ορό πασχόντων με την μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού.

3. Ανίχνευση φυσικών αντιγόνων. Τέτοια αντιγόνα είναι: ορμόνες, ένζυμα, οργανοειδικά αντιγόνα, εμβρυϊκά αντιγόνα, αντιγόνα όγκων, αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων, ερυθρών αιμοσφαιρίων καθώς και τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας. Πραγματοποιείται σε ιστούς και μεμονωμένα κύτταρα με την μέθοδο του άμεσου και του έμμεσου ανοσοφθορισμού.

4. Ανίχνευση μικροοργανισμών και συμπληρώματος στους ιστούς. Χρησιμοποιείται για την διάγνωση των αυτοάνοσων νόσων. Πραγματοποιείται με άμμεσο ανοσοφθορισμό.

5. Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων. Χρησιμοποιείται για την διάγνωση των αυτοάνοσων νόσων. Πραγματοποιείται με έμμεσο ανοσοφθορισμό.

In situ υβριδοποίηση με φθοριοχρώματα (FISH)

Εικόνα 10. Οι δεσμοί υδρογόνου ανάμεσα στις αζωτούχες βάσεις του DNA.
In situ στη βιολογία είναι η εξέταση ενός φαινομένου στο φυσικό του τόπο, χωρίς να μετακινηθεί. Στη γενετική χρησιμοποιείται κυρίως για να δηλωθεί ότι κάτι γίνεται μέσα στο χρωμόσωμα. Υβριδοποίηση ονομάζουμε τη διαδικασία ένωσης 2 τμημάτων νουκλεϊκού οξέος (κυρίως για ερευνητικό σκοπό). Με την επίδραση θερμοκρασίας είναι δυνατό να σπάσουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων των DNA και οι αλυσίδες του να απομακρυνθούν (αποδιάταξη). Οι δύο μονόκλωνες αλυσίδες μπορούν τώρα είτε να επανασυνδεθούν, είτε να συνδεθούν με άλλα συμπληρωματικά τμήματα νουκλεϊκών οξέων (υβριδοποίηση) που είναι ιχνηθετημένα με φθοριοχρώματα. Έτσι μπορούμε να δημιουργήσουμε υβρίδια RNA – DNA ή DNA – DNA. Η in situ υβριδοποίηση με φθοριοχρώματα (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) είναι μία κυτταρογενετική – μοριακή τεχνική, η οποία χρησιμοποιεί DNA ή RNA ιχνηθέτες/ανιχνευτές (probes) επισημασμένους με φθοριοχρωστικές. Με τη χρήση της FISH είναι δυνατός ο προσδιορισμός του αριθμού και της τοποθεσίας συγκεκριμένων ακολουθιών DNA σε κύτταρα. Ο ανιχνευτής είναι τμήμα DNA ή RNA το οποίο λόγω συμπληρωματικότητας των βάσεων (αδενίνη – θυμίνη ή ουρακίλη, κυτοσίνη – γουανίνη) ενώνεται με το χρωμόσωμα το οποίο θέλουμε να παρακολουθήσουμε. Οι αζωτούχες βάσεις του DNA είναι ενωμένες με δεσμούς υδρογόνου.

Πρώτα ο ανιχνευτής μετατρέπεται τεχνητά σε μονή αλυσίδα DNA (με θέρμανση ή με επαφή με αλκάλια) και μετά ενώνεται. Ο ανιχνευτής έχει επισημανθεί με φθοριοχρωστικές. Μία πολύ συνηθισμένη φθοριοχρωστική είναι η Digoxigenin η οποία βασίζεται σε αντισώματα.

• Εφαρμογές
Η διάγνωση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών στηριζόταν έως τώρα στον καρυότυπο με προγεννητικό έλεγχο. Ο προγεννητικός έλεγχος μπορεί να γίνει μη επεμβατικά με το τεστ του πρώτου τριμήνου, το τεστ του δευτέρου τριμήνου, το υπερηχογράφημα του δευτέρου επιπέδου αλλά και επεμβατικά με α) την αμνιοπαρακέντηση και β) τη λήψη χοριακής λάχνης. Καρυότυπος είναι ένα μεθοδικό σύνολο των χρωμοσωμάτων από ένα μόνο κύτταρο και περιλαμβάνει ένα σύνολο ποσοτικών και ποιοτικών χαρακτηριστικών των χρωμοσωμάτων. Ο καρυότυπος είναι η απεικόνιση των χρωμοσωμάτων ενός οργανισμού. Στο φυσιολογικό καρυότυπο του ανθρώπου εμφανίζονται 23 ζεύγη χρωμοσωμάτων, από τα οποία τα 22 ζεύγη ονομάζονται αυτοσωμικά ενώ το 23ο ζεύγος απαρτίζει τα φυλοκαθοριστικά χρωμοσώματα. Τα χρωμοσώματα έχουν σχήμα το οποίο μοιάζει με αυτό του γράμματος Χ, εκτός από ένα φυλοκαθοριστικό χρωμόσωμα στους αρσενικούς οργανισμούς που έχει σχήμα Υ.

Χρωμοσωματικές ανωμαλίες ονομάζονται οι μεταβολές των χρωμοσωμάτων που οφείλονται σε λάθη που συνήθως γίνονται κατά την διαίρεση του κυττάρου. Αυτά εντοπίζονται α) στη δομή (δομικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες), πχ. αναστροφή, μετατόπιση, έλλειψη, διπλασιασμός και β) στο πλήθος ( αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες) με πιο συχνή το σύνδρομο Down, όπου το αριθμημένο ως 21ο χρωμόσωμα υπάρχει στον καρυότυπο τρεις φορές (αντί για 2, ώστε να σχηματίζει ζεύγος που είναι το φυσιολογικό), το σύνδρομο Τurner που σχετίζεται με την έλλειψη ενός φυλετικού χρωμοσώματος σε θηλυκά άτομα, το σύνδρομο Klinefelter, που οφείλεται στην παρουσία ενός επιπλέον Χ, το σύνδρομο ΧΧΧ, που σχετίζεται με την ύπαρξη ενός επιπλέον φυλετικού χρωμοσώματος Χ σε θηλυκά άτομα και το σύνδρομο XYY, οφείλεται στην παρουσία ενός επιπλέον Y χρωμοσώματος στα αρσενικά άτομα.
Για να σχηματιστεί χρειάζεται το γενετικό υλικό να εξαχθεί από τον πυρήνα. Το γενετικό υλικό εξάγεται από κύτταρα που αναπαράγονται γρήγορα. Η διαίρεση αυτών των κυττάρων αναστέλλεται με κατάλληλες χημικές ουσίες στη μετάφαση προστίθενται χρωστικές και τα χρωμοσώματα παρατηρούνται στο μικροσκόπιο. Ο καρυότυπος είναι χρήσιμος γιατί οπτικοποιούνται μέσω αυτού άμεσα ο αριθμός, το είδος των χρωμοσωμάτων και τυχόν χρωμοσωματικές ανωμαλίες, τόσο στον αριθμό των χρωμοσωμάτων, όσο και στο είδος και στην κατασκευή των χρωμοσωμάτων. Οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες οφείλονται σε λάθη κατά τη μείωση για τη δημιουργία γεννητικών κυττάρων, άρα κληρονομούνται από τους γονείς στους απογόνους, χωρίς οι ίδιοι να πάσχουν απαραίτητα από κάποια ασθένεια. Χρωμοσωματικές ανωμαλίες παρατηρούνται και στη μίτωση, αλλά δεν επηρεάζουν τους απογόνους μας και συνήθως αυτά τα κύτταρα θανατώνονται.

Η ευαισθησία της τεχνικής FISH είναι ανώτερη της κλασσικής χρώσης των χρωμοσωμάτων με Giemsa (καρυότυπος) και της συγκριτικής υβριδοποίησης γενώματος (Comparative Genome Hybridization, CGH), ενώ οι παραλλαγές της FISH, η TSA-FISH (Tyramide signal amplification) και η νεότερη two-pass TSA-FISH είναι συγκρίσημες των μεθόδων PCR για την διερεύνηση ελάχιστου μεγέθους μοριακών διαταραχών <1 ζεύγος βάσεων).
Ειδικότερα με τη DNA-FISH είναι δυνατή η παρατήρηση μεμονωμένων γονιδίων, τμημάτων ή ολόκληρων χρωμοσωμάτων, η αποσαφήνηση ισορροπημένων ή όχι μεταθέσεων, η αναγνώριση χρωματοσωματικών διπλοποιήσεων και ανασυνδυασμών.

Οι τύποι ιχνηθετών που αποτελούν και το βασικότερο στοιχείο της μεθοδολογίας FISH διακρίνονται σε:
• ιχνηθέτες DNA επαναλαμβανόμενων ακολουθιών (repetitive DNA probes)
• σύνθετους ιχνηθέτες DNA (complex DNA probes)
• ή εξειδικευμένους γονιδιακούς ιχνηθέτες [gene specific probes, locus specific probes (LSI)]
και ιχνηθέτες ολόκληρων χρωμοσωμάτων (whole chromosome probes).

Πρώτα κατασκευάζουμε ένα probe. Αυτός πρέπει να είναι αρκετά μακρύς για να υβριδοποιείται πλήρως με το «στόχο» αλλά όχι υπερβολικά μακρύς. (Ο probe επισημαίνεται με τη φθορίζουσα ουσία). Μετά παίρνουμε ένα χρωμόσωμα το οποίο να βρίσκεται σε μετάφαση και το θερμαίνουμε ώστε να διαχωριστεί το δίκλωνο DNA. Ο probe έρχεται σε επαφή με το στόχο και αφήνεται σε αυτή την κατάσταση για περίπου 12 ώρες μέχρι να ολοκληρωθεί η υβριδοποίηση. Αφού ολοκληρωθεί αυτή η φάση ακολουθούνται κάποιες διαδικασίες «ξεπλύματος» για να απομακρυνθούν οι probes που δεν έχουν υβριδοποιηθεί ή δεν έχουν υβριδοποιηθεί πλήρως.
Εικόνα 15. Φθορίζονται σήματα χρωμοσωμάτων σε πυρήνες λεμφοκυττάρων. Τα ανιχνευτές έχουν προσδεθεί ειδικά με το κεντρομερίδιο κάποιων χρωμοσω-μάτων. Στην περίπτωση Α, φαίνεται γενετικό υλικό έξω από του πυρήνες, που σηματοδοτεί χρωμοσωματική απώλεια. Αυτό το γενετικό υλικό αυτό έχει σήμα φθορισμού, που σημαίνει ότι εκεί βρίσκεται χρωμόσωμα.

H FISH χρησιμοποιείται στην ιατρική ως εργαλείο διάγνωσης ποικίλων νεοπλασιών, εκτίμησης της πρόγνωσης ογκολογικών ασθενών και υποτροπών της νόσου. Θεωρείται ως η καταλληλότερη μέθοδος (gold standard) για την εξακρίβωση της ενίσχυσης του ογκογονιδίου HER2 στον καρκίνο του μαστού, την διερεύνηση χρωμοσωματικών μεταθέσεων σε νοσήματα του αιμολεμφομικού ιστού, σαρκώματα και προγεννητικών χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Χρησιμοποιείται επίσης για την μελέτη του μη σωστού διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων κατά τη μειωτική ή τη μιτωτική διαίρεση (Εικόνα 15)
Τα σήματα των ιχνηθετών γίνονται ορατά με μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας ειδικά φίλτρα για τον ακριβή διαχωρισμό των φθοριοχρωμάτων και πρόσφατα χρήση ειδικών μηχανών λήψης (CCD), η οποία προσέδωσε στην τεχνική FISH μεγάλη ευαισθησία, αλλά και δυνατότητες ποσοτικής μέτρησης των εικόνων φθορισμού και ανίχνευσης σημάτων σε μήκη κύματος πέραν του ορατού για το ανθρώπινο μάτι φάσματος. Η FISH είναι δυνατόν να εφαρμοσθεί και σε κυτταρολογικό και βιοπτικό υλικό μετά από ειδική επεξεργασία.

Βιβλιογραφία
Πηγές από διαδίκτυο
1. http://el.wikipedia.org/wiki/%CE%9A%CE%B1%CF%81%CF%85%CF%8C%CF%84%CF%85%CF%80%CE%BF%CF%82
2. http://gynaikologos-manolis.pblogs.gr/2009/02/432388.html
3. http://www.gynekologia.gr/cmg/index.php?option=com_content&task=view&id=47&Itemid=65
4. http://www.aimodiagnosi.gr/images/uploaded/doctors_xromosomikes_anomalies.pdf
5. http://www.microdiagnostics.gr/moriakes/fish.html
6. http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_in_situ_hybridization
7. http://en.wikipedia.org/wiki/Hybridization_probe
8. http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_the_life_sciences
9. http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_marker
10. http://el.wikipedia.org/wiki/%CE%A6%CE%B8%CE%BF%CF%81%CE%B9%CF%83%CE%BC%CF%8C%CF%82
11. http://flowcyt.salk.edu/fluo.html
12. http://www.aua.gr/fasseas/optika%20mikroskopia.htm
13. http://www.pkarkalousos.gr/Web_Lessons/Lessons/IEK_Notes/IEK_Diagnoseis/IEK_Diagnoseis_IFA_Karkalousos.pdf
14. http://www.mycitynet.gr/web/article.php?id=212&cat=3000&subcat=3003&subsubcat=
15. http://www.tovima.gr/relatedarticles/article/?aid=18152
16. http://www.google.gr/imgres?q=%CE%B1%CE%BD%CE%BF%CF%83%CE%BF%CF%86%CE%B8%CE%BF%CF%81%CE%B9%CF%83%CE%BC%CE%BF%CF%82&hl=el&client=firefox-a&rls=org.mozilla:el:official&biw=1280&bih=834&gbv=2&tbm=isch&tbnid=DD_S7W2esjoAdM:&imgrefurl=http://www.aua.gr/fasseas/optika%2520mikroskopia.htm&docid=ebn5M7ubDb03rM&imgurl=http://www.aua.gr/fasseas/imunofluorescence.jpg&w=780&h=299&ei=wSGdTrLbIo3Vsga8gsSNCQ&zoom=1&iact=hc&vpx=789&vpy=190&dur=281&hovh=78&hovw=203&tx=187&ty=85&sig=107059709560820948440&page=1&tbnh=78&tbnw=203&start=0&ndsp=21&ved=1t:429,r:3,s:0
17. http://www.google.gr/imgres?q=%CE%B1%CE%BD%CE%BF%CF%83%CE%BF%CF%86%CE%B8%CE%BF%CF%81%CE%B9%CF%83%CE%BC%CE%BF%CF%82&hl=el&client=firefox-a&rls=org.mozilla:el:official&biw=1280&bih=834&gbv=2&tbm=isch&tbnid=AYzJEs_H72PpOM:&imgrefurl=http://www.sitemaker.gr/kekbio/page_GREEK_6.htm&docid=q8gxDgpqFpKHPM&imgurl=http://www.sitemaker.gr/kekbio/assets/antibodies.jpg&w=700&h=537&ei=wSGdTrLbIo3Vsga8gsSNCQ&zoom=1&iact=rc&dur=364&sig=107059709560820948440&page=1&tbnh=145&tbnw=189&start=0&ndsp=21&ved=1t:429,r:1,s:0&tx=129&ty=108

Ευχαριστίες
Ευχαριστούμε την κ. Στεφάνου Γεωργία και τον Καθηγητή κ. Δημόπουλο Νικόλαο, καθηγητές του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, καθώς και του μεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου Κυτταρογενετικής, του Βιολογικού τμήματος για την επίδειξη των μικροσκοπίων φθορισμού και της τεχνικής FISH.
 

Visitors:543
Date created:11/28/11
Last change:11/28/11

Impressio eJournal © 2014 ARSAKEIO OF PATRA  - ENVIRONMENTAL PROJECTS Switch to Library level